組織游離膽固醇測(cè)試盒（酶法）(Tissue free cholesterol )

描述：在實(shí)體組織和細(xì)胞內(nèi)，膽固醇酯既是構(gòu)成細(xì)胞質(zhì)膜的成分，也是細(xì)胞內(nèi)脂滴的主要組分。細(xì)胞內(nèi)膽固醇過度聚集與動(dòng)脈粥樣硬化泡沫細(xì)胞形成密切相關(guān)。實(shí)體組織和細(xì)胞的膽固醇測(cè)定遠(yuǎn)比血液膽固醇測(cè)定復(fù)雜。本試劑盒避免了有毒的有機(jī)溶劑抽提、繁雜的氮?dú)獯蹈珊椭|(zhì)復(fù)溶等步驟，采用高效能試劑裂解細(xì)胞和提取膽固醇，優(yōu)化了酶學(xué)反應(yīng)和操作步驟，簡(jiǎn)單易行，靈敏度高，線性范圍20~5000 µmol/L。

原理：本試劑盒采用WHO、中國《全國檢驗(yàn)操作規(guī)程》的酶學(xué)方法，結(jié)合經(jīng)典GPO Trinder酶學(xué)反應(yīng)^1,2，原理如下：(1) 膽固醇酯酶分解膽固醇酯為游離膽固醇。(2) 膽固醇氧化酶將游離膽固醇氧化，反應(yīng)過程產(chǎn)生過氧化氫。(3) 在過氧化物酶催化下進(jìn)行生色反應(yīng)，在550nm有大吸收峰，光密度值與膽固醇濃度成正比。

參考文獻(xiàn)

1、Trinder P. Ann. Clin. Biochem. 1969, 6: 24-27.

   2、Barham D and Trinder P. Analyst. 1972, 97: 142-145

適于測(cè)定樣品：(1) 動(dòng)物實(shí)體組織     (2) 培養(yǎng)細(xì)胞      (3) 細(xì)胞膜組分

組成 (105次微板測(cè)定或30次1 ml比色杯測(cè)定)：

(1)    裂解液 50 ml    (2)R1試劑 16 ml    (3)R2試劑 4 ml     (4)5 mmol/L膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品0.5 ml

儲(chǔ)存：4 ºC，儲(chǔ)存三個(gè)月

所需設(shè)備：酶標(biāo)儀、生化分析儀或721、722型可見光分光光度計(jì)。佳工作波長(zhǎng)550nm，如無此波長(zhǎng)建議優(yōu)先選用570nm、次選530、490nm。

操作步驟；

一. 組織細(xì)胞裂解:

裂解前，組織或細(xì)胞用PBS洗滌2次去除殘存血液或培養(yǎng)基血清，以免影響膽固醇測(cè)定。

1)      培養(yǎng)細(xì)胞裂解：

消化、離心收集細(xì)胞或直接在培養(yǎng)皿內(nèi)裂解。通常6孔板單孔約2x10⁶個(gè)細(xì)胞，75cm²瓶約1x10⁷細(xì)胞。按比例每1x10^6個(gè)細(xì)胞加0.1ml裂解液，震蕩混勻，靜置10分鐘。

2)      細(xì)胞膜成分：

每5x10⁶細(xì)胞制備的細(xì)胞膜組分，加入0.1-0.2ml裂解液（應(yīng)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整裂解液的量），震蕩混勻，靜置10分鐘。

      3)     動(dòng)物組織裂解：

切記要預(yù)先將新鮮組織剪切稱重后再進(jìn)行保存。組織凍存后再進(jìn)行解凍、剪切、稱重可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的測(cè)量誤差。離心管精確稱重，加入組織塊后再稱重，二者相減(即減量稱重法)計(jì)算組織重量(約100mg)。強(qiáng)烈建議按比例每1mg組織加10µl裂解液以減少樣品間蛋白和脂質(zhì)含量變異而產(chǎn)生的誤差。（注意；裂解液用量在1ml或更多可保證有效的裂解與脂質(zhì)提?。Ｓ秒妱?dòng)高速勻漿器或手動(dòng)玻璃勻漿器破碎組織。（不超聲方法，因其不能*和均勻破碎。應(yīng)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整初始的組織細(xì)胞加入量），而后靜置10分鐘。

二. 組織細(xì)胞裂解液處理

1.    取適量上清液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管，進(jìn)行步驟2的操作。余下的裂解液用BCA法蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，或－20ºC儲(chǔ)存。

2.    可選的優(yōu)化步驟：70ºC加熱10分鐘，可能出現(xiàn)絮狀沉淀。（此步驟即可在組織量多、膽固醇含量高時(shí)采用）。

3.    室溫2000g離心5分鐘，取上層清液用于酶學(xué)測(cè)定。

注意：如果得到上清的上層有較多的白色乳濁樣小顆粒，重復(fù)步驟2和3。

三、工作溶液配制: 按4:1比例，取4 ml試劑R1與1 ml試劑R2混勻，立即使用或4ºC保存<1天，變色棄去。

四、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：將5 mM膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品用無水乙醇稀釋為2500、1250、625、312.5、156、78、39µmol/L。通常稀釋4個(gè)點(diǎn)即可。注意設(shè)置零濃度空白對(duì)照管。

五、含量測(cè)定：

1.    取190 µl工作溶液加入微板。

2.    在各工作液中，分別加入10 µl (5~10µl) 空白對(duì)照溶液（無水乙醇或蒸餾水均可）、標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品。樣品體積不可超過20µl。如測(cè)量值超過線性范圍可用裂解液稀釋，根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算濃度。

3.    37ºC或25ºC室溫反應(yīng)20分鐘然后進(jìn)行測(cè)定。（延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間可能使游離膽固醇值增加，進(jìn)而使游離膽固醇的數(shù)值與總膽固醇值接近。）

4.    先用蒸餾水（或無水乙醇）+工作液的空白管調(diào)零，然后測(cè)定各管OD值。

5.    繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算濃度。

Excel作圖步驟：各標(biāo)準(zhǔn)管OD值為y軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為x軸。(1)鼠標(biāo)左鍵圈住數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊-做圖向?qū)?/font>-，選擇-散點(diǎn)圖-，點(diǎn)擊-完成-。(2)鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)圖上的某一點(diǎn)，點(diǎn)擊 -添加趨勢(shì)線-，點(diǎn)擊 -選項(xiàng)-，點(diǎn)擊 -顯示公式-和 -R²值-。

6.    以每mg蛋白濃度或細(xì)胞數(shù)校正膽固醇含量。

組織膽固醇酯測(cè)定：需同分別測(cè)定組織總膽固醇和游離膽固醇，二者的差值即為膽固醇酯含量，參見以下說明。

說明：

1. 維生素C>0.18g/L、血紅蛋白>2g/L、還原劑二硫蘇糖醇、巰基乙醇、高濃度EDTA干擾測(cè)試。

2. 不同類型的組織細(xì)胞內(nèi)總膽固醇和游離膽固醇的比例差異很大。延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間可能使游離膽固醇值增加因而使其值與總膽固醇值接近。由差值計(jì)算求得的膽固醇酯的值，主要適合血液樣品測(cè)定，可能不很適合細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯測(cè)定。其原因主要與細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯和游離膽固醇的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、外流、儲(chǔ)存、分解、再酯化等諸多動(dòng)態(tài)生物過程的非線性的高度復(fù)雜性有關(guān)，還與現(xiàn)有測(cè)量方法的局限性有關(guān)。膽固醇(酯)的含量以及代謝方式在肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等不同類型的細(xì)胞中存在巨大差異。有時(shí)以差值計(jì)算的膽固醇酯出現(xiàn)背離和偏差，甚至為負(fù)值。如果出現(xiàn)這種情況，建議在數(shù)據(jù)分析時(shí)采用膽固醇酯/總膽固醇比值，而非膽固醇酯絕對(duì)值；或者嘗試用同位素標(biāo)記方法、薄層層析、HPLC等方法測(cè)定膽固醇酯，或許會(huì)有改善。