信帆生物分享：免疫組化實驗中zui容易遇到的問題及解決方案

案例一：DAB染色后切片著色一片黃/背景深

背景：奧運會期間我們課題組研究生都在實驗室做實驗，許多從北京購買的試劑買不到，對我們的許多實驗產生了很大的影響。我以前一直用中杉金橋的Sp三步法染色試劑盒，效果不錯，在奧運會期間我準備做同批實驗分不同批次酶免疫組化實驗，*批組化實驗結果很好，抗體濃度感覺比較合適(Santa Cruz公司1：200)，等做第二批時發現封閉血清不夠了，為了保證實驗順利進行，我又從福州邁新頂了一個SP試劑盒，同時抗體稀釋液也不夠了，我又重新從博士德公司買了一小瓶10ml。從第二批實驗開始，組化實驗結果一直顯示強背景著色，特異性染色很難辨別。

問題及其解答：產生組織切片非特異性染色的原因有哪些?如何解決?

1、 抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是zui重要的一條。

2、 一抗用多克隆抗體易出現非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。

3、內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細胞多的組織)，需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色;

4、 非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果;

5、 DAB孵育時間過長或濃度過高;

6、 PBS沖洗不充分，殘留抗體結果增強著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要;

7、 標本染色過程中經常出現干片，這容易增強非特異性著色。

我的實際解決方案：

以上的分析可能對于初學者還是不容易的，下面我就把我的排除實驗的具體過程與大家進行分享、交流和討論。

1、首先排除抗體孵育條件。一般來說，著色效果的好壞與抗體的孵育條件是密不可分的，由于用SP法已經做出來過一次且效果不錯，因此對于同樣組織的同一抗原進行分析，這種因素可以先排除。

2、其次，DAB孵育時間是否太長?做出來那一次我是孵育8min，后來也是8-10min，我單獨做了一次實驗來排除該因素。結果孵育2、5min時先出現背景，而特異性染色較淺，故這不符合常理，一般先出現特異性染色，然后隨著時間的延長，會出現非特異性背景著色。

3、zui后，血清封閉的問題?以前我一般孵育15-30min，所以我單獨做了一次實驗用血清封閉室溫1h，其它條件同做出來的那一次，結果也一樣背景著色很深。

4、此外，我在改進的同時，也對PBS清洗不斷地延長時間和增加次數，甚至*參照試劑盒說明書來進行操作(我以前一般一抗4度過夜且室溫復溫45min、二抗37度30min、Sp反應37度30min)，以及過氧化氫滅活加強等等均未起到效果。

我冷靜地分析了一下整個實驗流程，與*次做出來相比，只有兩個地方做了改動：因血清不夠而更換了不同廠家試劑盒、因抗體稀釋液用完而重新買了抗體稀釋液。

5、我用PBS替代一抗稀釋液(我以前還回收抗體，自我覺得抗體稀釋液中含防腐劑和蛋白穩定劑)，其它步驟和組織切片*與*次做出來的一致(包括血清也是老試劑盒內剩余的一點)，奇跡出現了：結果很好。--因為抗原抗體反應除溫度、抗原/抗體濃度外，然后就是PH值，于是我測了新抗體稀釋液、老抗體稀釋液和PBS的PH值，結果是前者偏酸性(<6、0)，而后兩者均在7、5左右。

6、看來主要禍根是抗體稀釋液的PH值出問題了，于是我又用PBS替代抗體稀釋液和新試劑盒內的試劑對組織切片做了免疫組化，結果還是沒有做出來：背景很深。這真把我搞慘了。難道還有什么原因嗎?通過仔細分析：一抗一定是結合上去了(老SP試劑盒結果很好)，問題是二抗沒有結合上去也不對(因為zui后背景很深，這說明二抗可能也結合上去了)，DAB孵育時間現在只用1、5min也是背景深而特異性染色淺，那我又懷疑封閉血清了。

7、我做了兩張切片：一張用老試劑盒內還剩下一點的血清而另一張用新試劑盒內的封閉血清，其余試劑(二抗、SP)均用新試劑盒提供的，結果是前一張效果很好，而后一張能夠看到特異性染色，但背景太深，拍照效果不佳。--看來封閉血清也是罪會禍首之一。

結果分析顯示：抗體稀釋液的PH值偏低和封閉血清的失效導致了我的免疫組化結果的不佳，望大家在以后的組化實驗中也要注意這兩個不太引人注意的關鍵問題。--慘痛的教訓，值得引以為鑒。

案例二：DAB染色后切片著色呈陰性結果

背景：其實免疫組化在DAB染色后一般有四種情況：陽性染色效果很好、陰性染色、非特異性染色很深、陰陽臉(染色不均勻)。而陰性染色是許多初學者經常遇到的頭疼問題。我身邊有個研究生同學在我們實驗室初次涉入免疫組化，聽說步驟不難，跟我后面做了幾次之后，就自己開始做了，連續做了三次，結果均是陰性染色。很掃興，不知是什么原因導致的。

問題及其解答：免疫組化染色呈陰性結果的原因有哪些?

1、抗體濃度和質量問題以及抗體來源選擇錯誤。不知抗體是進口的還是國產的工作液，怎么這么高稀釋度也沒能做出陽性結果?另外，不是抗體濃度越高就越易出現陽性結果，抗原抗體反應有前帶和后帶效應，必須摸索濃度。

2、抗原修復不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來打開抗原表位，以利于與抗體結合;建議微波修復用高火4次*6min試試。有人做過實驗，這是的時間和次數。若不行，還可高壓修復。

3、組織切片本身這種抗原含量低;

4、血清封閉時間過長。

5、DAB孵育時間過短。

6、細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內參與反應。

7、開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個陽性對照片，排除抗體等外的方法問題。

我的實際解決方案：

1、首先，排除組織切片內的抗原有無丟失及其含量多少。免疫組化中兩個zui重要的因素是抗原和抗體。(1)抗原有無丟失主要看組織切片的新鮮程度，一般切片室溫保存超過3-6個月，可能切片內的抗原丟失很嚴重(有文獻支持)，此時可以通過重新用石蠟塊切片來進一步驗證(蠟塊需要低溫保存)。(2)石蠟切片在制作過程中可能因醛基對抗原決定族的封閉，這需要通過抗原修復來充分暴露，從而增加抗原抗體結合反應，提高陽性率，我一般用6min*4次中火微波抗原修復，用枸櫞酸鈉緩沖液。(3)組織切片中本身抗原含量的多少?這方面我有教訓的，我做胎鼠丸間質細胞鑒定，用1：200一抗效果很好;但我用1：200一抗孵育成年丸間質細胞檢測，幾乎呈陰性，后來證實是因為兩者抗原含量相差甚遠，則一抗也要適當提高濃度。

2、其次，檢查抗體有無選擇錯誤和抗體孵育條件是否不適。(1)一抗選擇單克隆抗體易出現陰性結果，因為靈敏度低但特異性好;一抗的species reactivity中無檢測組織的種屬，這是比較常見的錯誤;一抗選擇rat，而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出現陰性結果。(2)抗體孵育時間過短，容易導致陰性結果。一般一抗我建議4度孵育過夜和37度復溫45min;二抗我一般37度30min。我不喜歡參照二抗染色試劑盒說明書。(3)抗體濃度過低。這是陰性結果的zui可能原因。必須提高稀釋度，我一般初次做一種新抗體，喜歡先用說明書建議的低濃度和高濃度做一次，然后決定是向高還是低方向摸索。一般先決定二抗的濃度(工作液就好辦了，直接滴加)，重點摸索一抗的zui適濃度。注意：免疫反應中存在前帶和后帶效應，這提示不是濃度越高，陽性率就越高，反之亦然。(4)重要原因排除之后，也不要忽視抗體的質量：原裝抗體一般比較穩定，效果較好;而進口分裝次之;工作液可能要注意質量問題。

3、同時，DAB的孵育時間可能要適當延長，在鏡下觀察，有時可延長至30min。但一般3-10min，此時背景也較淺。否則，說明抗體濃度不合適。

4、zui后，血清封閉時間也可相應縮短。一般10-30min，但這個時間可以調整，封閉主要是降低切片的總體背景著色。

5、此外，細胞通透也不可忽視。許多戰友認為石蠟切片一般不需細胞通透，因為切片時可能已經把細胞切開了，但對于胞核蛋白，建議還是通透一下，促進抗體等試劑充分進入參與反應。

6、以上原因，都是針對實際中常見原因來進行分析的，前提是排除操作者的操作錯誤而引起陰性結果，這就需要新手還是要設置陽性對照以排除方法的問題。還有抗體稀釋液的PH值過低等其它原因的干擾。

總之，要想把免疫組化做好，可能每一個環節都很重要，但也存在主次之分，出現問題了，需要通過先排除主要的，再依次排除次要的--這是衡量你對免疫組化原理掌握與否的關鍵所在。

案例三：石蠟切片免疫熒光染色呈陰性結果或非特異性結果

背景：因實驗需要，于2008年07月04日初次做肝臟組織ZO-1(一種胞膜蛋白，緊密連接蛋白)免疫熒光染色，以前我對酶免疫組化非常熟悉，在園子內也有不少置頂貼和精華帖，但免疫熒光一直還沒做過(原理知道，但細節不太了解)。我先用石蠟切片做了5次，結果一直不理想(表現為未見特異性強染色);近幾日，我又切了冰凍切片，做了2次，終于基本成功了。在這個過程中，我對免疫熒光染色技術有了全新的認識，而前些天發出免疫熒光求助貼，回復的很少，所以有必要加強對免疫熒光方面的討論)，不妥之處敬請指正。有人會問酶免疫組化做的好好的，為何要做免疫熒光?其實，這也是我以前思考的難題，現在我認為可能胞膜蛋白含量不高，用普通免疫免疫組化可能做不出來，需要敏感的免疫熒光方法來進行蛋白檢測(我是看許多外文文獻都是這樣做的，因此選擇免疫熒光染色。)

信帆生物分享：免疫組化實驗中zui容易遇到的問題及解決方案