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基質金屬蛋白酶(MMP)明膠酶譜法電泳試劑盒(MMP2/9)

點擊次數:1371     更新時間:2016-11-16

基質金屬蛋白酶(MMP)明膠酶譜法電泳試劑盒(MMP2/9),現貨供應!可檢測樣本750個,操作方便,使用簡單,經濟實惠,咨詢!

  1. 簡介:

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌,活化后能夠降解細胞外基質的膠原蛋白,又稱膠原酶。通過影響細胞外基質,膠原酶參與胚胎發育、形態發生、組織重塑等過程,并參與炎癥、腫瘤、、神經等許多疾病過程。血漿與組織中的MMP-2MMP-9參與各種生理與病理過程,其在診斷和治療中的意義日益受到重視。

基質金屬蛋白酶(MMP)明膠酶譜法電泳試劑盒(MMP2/9)

2. 檢測原理:

本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測MMP-2MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法,其靈敏度可達1 nM,高于ELISA方法,其基本原理和程序是:制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠,含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電泳,電泳結束后取出凝膠與酶反應Buffer 孵育,凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染,形成深色背景,但在有蛋白酶條帶的位置,蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白,因而不被染色而形成透亮區域,從而能同時指示MMP-2MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2MMP-9 特異蛋白底物及酶學反應緩沖液,可檢測少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2MMP-9 酶譜及活性,檢測靈敏度~1nM。試劑盒可進行50次標準小膠檢測,如果小膠加樣孔為10~15個,則總計可檢測500~750個樣品。

 

3. 檢測目的:

本試劑盒用于檢測MMP-2、MMP-9 酶譜及活性(Detect MMP2 and MMP9 as low as 1nM)。

 

基質金屬蛋白酶(MMP)明膠酶譜法電泳試劑盒(MMP2/9)

 

4.  試劑盒組成與儲存:

   A. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, −20 ºC

   B. 10 × Substrate G, 50 ml, −20 ºC

   C. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋;

   D. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋;

   E. SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液, 4 ºC

 

5.檢測步驟

5.1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠:分離膠濃度為8%。按照標準程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化,并90 ºC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍,混勻后加入過硫酸銨和TEMED,等待凝膠聚合。

5.2 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上樣。切勿加熱變性,并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預試驗確定加樣量,使用普通蛋白預染Marker 即可。

陽性對照(可選步驟):可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合,取5-15μl 上樣。

注:因為全血成分復雜,MMP活性較低,的方法是將全血中白細胞進行分離做陽性對照

   5.3 低電流恒流電泳,每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結束電泳。

5.4 洗滌凝膠:取出凝膠,去除濃縮膠,放入容器內。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠,然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋),室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。

5.5 孵育:倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),室溫或37ºC 孵育1~5 小時。陽性對照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時即可顯示。如MMP 活性低,應延長孵育時間為10小時或過夜。

5.6 顯色:倒掉Buffer B,加入SDS-PAGE凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液(操作步驟見后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書)。凝膠的大部分區域被深染,在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區域。

透明區域的位置和范圍指示MMP-2MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72 (MMP-2)92 (MMP-9)130 (proMMP-9)225 (proMMP-9) kDa位置出現透明條帶。

5.7 條帶掃描:將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明,但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法:可用非透射光掃描,或用軟件圖像處理程序調整背景顯示為灰度顯示,并盡量設置為黑色。MMP 條帶則為白色,這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。

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